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高純度質粒大量快速提取試劑盒

HighPure Rapid Maxi Plasmid Kit

保存條件：本產品收到后按照上面指示溫度存放各成份，儲存 18 個月不影響使用效果。

產品介紹：

本試劑盒采用改進 SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH 值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫。

產品特點：

離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。

不需要使用有毒的苯酚、氯fang等試劑，也不需要乙醇沉淀。快速、方便，從 100-200ml 大腸桿菌 LB 培養液中，可快速提取 0.2-0.5mg 純凈的高拷貝質粒 DNA，提取率達80 %左右。

 3. 獲得的質粒產量高、超螺旋比例高、純度好，可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

注意事項：

1. 第--次使用時，將試劑盒所帶全部的 RNase A 加入溶液 P1 后（終濃度 100μg/ml） 置于 4℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的質粒可能會有微量 RNA 殘留， 在溶液 P1 中補加 RNase A 即可。

2. 環境溫度低時溶液 P2 中 SDS 可能會析出出現渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

3. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH 值變化。

4. 溶液 P3 和去蛋白液 PD 中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

5. 提取質粒的量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質粒或大于 10kb 的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加 P1、P2、P3 的用量， 洗脫緩沖液應在 70℃預熱。可以適當的延長吸附和洗脫的時間，提高提取效率。

得到的質粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260 值為 1 相當于大約 50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為 2 條或者多條DNA 條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 90%。洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫， 但應該確保 pH 大于 7.5，pH 過低影響洗脫效率。用水洗脫，質粒應該保存－20℃。質粒DNA 如果需要長期保存，可以用 TE 緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA， pH 8.0），但是 EDTA 可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

自備試劑：無水乙醇

操作步驟：

提示：

ð 第--次使用前請先在漂洗液 WB 瓶中加入 200ml 無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

ð 將 RNase A 全部加入溶液 P1 中，混勻。每次使用后置于 2-8℃保存。

ð 將溶液 P3 放在冰上預冷。

1. 柱平衡步驟：向吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中）加 1ml 平衡液 BL，12,000rpm

離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當天處理柱子）

2. 取 100-200 毫升過夜培養的菌液，6000xg 離心 10 min，盡可能的倒干上清，收集菌體。

3. 用 7ml 溶液P1 重懸菌體沉淀，移液器吹打或者渦旋振蕩至*懸浮。

4. 加 7ml 的溶液P2，溫和地上下翻轉 4 -7 次使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。

5. 加 10ml 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉 4 -7 次，充分混勻此時會出現白色絮狀沉淀。冰上靜置 5-10 min，4℃條件下 2500xg 離心 20 min(加大離心力可相應縮短離心時間, 如 15000xg 離心 10 min)，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。

6. 將上一步所得上清加入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中），靜置 2 min，2500xg

離心 2 min，倒掉收集管中的廢液。

7. 加入 10ml 去蛋白液 PD，2500xg 離心 2 min，棄掉廢液。

8. 加入 10ml 漂洗液 WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），2500xg 離心 2 min，棄掉廢液。

9. 重復操作步驟 8。

將吸附柱 AC 放回空收集管中，g速（h大于 9000xg，如果離心機轉速低，需要相應延長離心時間）離心 10 min，去除基質膜上的乙醇殘留，用槍頭吸除內圈壓環和柱壁之間可能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾干幾分鐘。

11. 可選步驟: 選擇以下兩種方法之一干燥柱子：

a. 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空 15 min；

b. 將柱子放置于 60-65℃真空干燥箱或烘箱中，放置 10-15 min。

12. 取出吸附柱 AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 1-1.5ml 洗脫緩沖液EB（事先在 65-70℃水浴中預熱效果更好），室溫放置 2 min，6000xg 離心 5 min。需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心 2 min。（注意：洗脫液的 pH 值對于洗脫效率有很大影響。(注意：若用 ddH2O 做洗脫液應保證其 pH 值在 7.5-8.0 圍內，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率。洗脫緩沖液用量的多少主要是依據質粒的拷貝數以及實驗所需要的濃度來確定。洗脫緩沖液體積不少于 1 ml，體積過小影響回收效率。DNA 產物應保存在-20℃，以防 DNA 降解。）

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